隨著CAR-T療法獲批上市，優(yōu)化CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝成為迫切需求，市場急需更高效、成本更低的細(xì)胞生產(chǎn)工藝。2017年全封閉自動化CAR-TXpress™系統(tǒng)正式進入CAR-T市場，為全球帶來新一代CAR-T生產(chǎn)工藝，可實現(xiàn)CAR-T細(xì)胞高效率、低成本生產(chǎn)，備受矚目。近日，《CELL & GENE THERAPY INSIGHTS》雜志采訪了這項創(chuàng)新技術(shù)平臺的主要發(fā)明者Philip H Coelho，深入了解新一代CAR-T生產(chǎn)工藝CAR-TXpress™。

Philip H Coelho

Philip H Coelho先生是博雅控股集團旗下熱動力醫(yī)療（ThermoGenisis, 納斯達克股票代碼：KOOL）的首席技術(shù)官(CTO)。他是一位工程師，也是一位發(fā)明家，已獲得40多項與細(xì)胞分選、細(xì)胞清洗、自動化細(xì)胞凍存、低溫自動化機械技術(shù)、血液內(nèi)凝血蛋白的收集相關(guān)的美國專利。

在職期間， Coelho先生開發(fā)了Thermoline超快速血漿冷凍機和解凍機、CryoSeal自動化系統(tǒng)（將手術(shù)患者血液制成纖維蛋白膠）、BioArchive®機械系統(tǒng)（用于胎盤/臍血造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞（HSPC）的程序降溫和低溫凍存）以及AutoXpress®系統(tǒng)（將臍血中的HSPC無菌自動收集至25ml雙室冷凍袋）。BioArchive®系統(tǒng)以及AutoXpress®系統(tǒng)已在全球樹立臍血處理以及存儲的GMP最高標(biāo)準(zhǔn)。

9年來，Coelho先生與其工程師和細(xì)胞生物學(xué)家精英團隊開發(fā)了符合GMP規(guī)范的新一代可編程系統(tǒng)，能提高從外周血、胎盤/臍帶血、骨髓和白細(xì)胞產(chǎn)品中分離純化干/祖細(xì)胞和免疫細(xì)胞的速度和效率。這些研究項目演化成為CAR-TXpress™技術(shù)平臺，這是一種自動化、全封閉的生物制造平臺，能夠大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量、臨床級CAR-T細(xì)胞。

Q：CAR-T生產(chǎn)工藝中哪些環(huán)節(jié)可以實現(xiàn)自動化或半自動化？

Coelho先生：CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可以實現(xiàn)自動化，現(xiàn)如今行業(yè)迫切需要推進生產(chǎn)自動化。值得注意的是，每一次的白細(xì)胞去除術(shù)（leukapheresis）都能從健康供體中獲取約5×10⁹個T細(xì)胞。這個數(shù)量遠高于實際注入患者體內(nèi)的基因修飾T細(xì)胞的數(shù)量（諾華Kymriah™：0.2-5×10⁶/kg，凱特Yescarta™：2×10⁶/kg）。更讓人擔(dān)心的是，采用當(dāng)前手工生產(chǎn)工藝，可輸注的T細(xì)胞數(shù)量會隨著一周或更長的擴增周期而大量損耗。

整個工藝流程均會發(fā)生關(guān)鍵細(xì)胞損耗，但最嚴(yán)重的可能發(fā)生在第一階段——從患者血液中收集單個核細(xì)胞（MNC），進行T淋巴細(xì)胞分離。常年在實驗室生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞的專業(yè)人員告訴我們，當(dāng)前的手工工藝可導(dǎo)致細(xì)胞損耗率高達50%至90%，因此將此生產(chǎn)環(huán)節(jié)自動化尤為重要。

優(yōu)良的自動化工藝應(yīng)能夠在去除血小板、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及清洗冷凍保護劑二甲亞砜（DMSO）的同時，將MNC損耗最小化，獲取純化的MNC，從而有效分選T細(xì)胞。成功的自動化系統(tǒng)還需要克服因不同來源的患者血液所帶來的嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險（現(xiàn)采或凍存的外周血或白細(xì)胞去除術(shù)的產(chǎn)品）。

下一個需要自動化的環(huán)節(jié)是從MMC中分選T淋巴細(xì)胞。自動化分選必須獲取高純度T細(xì)胞，以求最大限度提高下游處理效率?？贵w分選后殘余在T淋巴細(xì)胞群中的單核細(xì)胞會降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和T細(xì)胞的擴增。此外，如果單核細(xì)胞殘余量較大（常發(fā)生于傳統(tǒng)磁珠分離過程），采用人工方法清除這些單核細(xì)胞亦無法避免目標(biāo)T細(xì)胞再次損耗。

獲取高純度T細(xì)胞后，優(yōu)良的自動化激活工藝可避免再次引發(fā)并發(fā)癥。例如，某些用于激活的磁珠產(chǎn)品本身就是個大問題，為此FDA要求臨床醫(yī)師在清洗前后對磁珠進行計數(shù)（磁珠數(shù)量常大于需要激活的細(xì)胞量）。當(dāng)然，F(xiàn)DA不希望與細(xì)胞大小相同的磁珠隨細(xì)胞輸入患者體內(nèi)。

Q：您對企業(yè)采用自動化設(shè)備有何建議，理想情況下，這種投資何時能見到回報？

Coelho先生：如果是生產(chǎn)小部件，那么簡單的投資回報（ROI）分析就可以。但我們并不是在生產(chǎn)小部件,而是在努力收集足量具有可行性的基因修飾T細(xì)胞，用來拯救生命，因此患者的生存率才是分析的關(guān)鍵。當(dāng)然，硅谷制造模式值得參考：制造商升級芯片自動化生產(chǎn)工藝后，生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本降低，同時產(chǎn)品質(zhì)量也得以提升。

然而，芯片制造商是不會遇到生物制藥領(lǐng)域這種復(fù)雜問題的——患者提供的原始細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上差異很大，生產(chǎn)設(shè)備的各個自動化環(huán)節(jié)需要在降低目標(biāo)成本的同時，既要縮短生產(chǎn)耗時，又要提升細(xì)胞回收率、活率、純度及穩(wěn)定性。

目前，將患者細(xì)胞輸入自動化生產(chǎn)設(shè)備系統(tǒng)后，我們并不能隨即從設(shè)備另一端口輕易獲取可用于治療的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品。但是，在生產(chǎn)工藝流程中系統(tǒng)地引入自動化模塊將能簡化現(xiàn)有生產(chǎn)工藝，從而更易實現(xiàn)整個工藝流程的全自動化。

Q：與非自動化制造方法相比，CAR-TXpress™系統(tǒng)性能如何？

Coelho先生：我們相信，與傳統(tǒng)手工生產(chǎn)系統(tǒng)相比，我們的自動化模塊將在MNC純化、細(xì)胞清洗、抗體分選以及T細(xì)胞激活方面表現(xiàn)更佳，并且大幅縮短處理時長。

有文獻指出，采用Ficoll法從外周血中分離MNC，目標(biāo)MNC的損耗率大于30%，且耗時近

4小時。我們的自動化、全封閉系統(tǒng)X-LAB ™系統(tǒng)在30分鐘左右即可實現(xiàn)MNC回收率大于90%，同時去除紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及血小板。

文獻還指出，采用常規(guī)手工工藝或是第一代機械化工藝清洗已復(fù)蘇白細(xì)胞產(chǎn)品導(dǎo)致T細(xì)胞損耗率高于30%。相反，自動化、全封閉系統(tǒng)X-WASH™能實現(xiàn)冷凍保護劑二甲亞砜（DMSO）去除率保持在99%以上，且T細(xì)胞損耗率低于10%，這比傳統(tǒng)磁珠分離法高出10%至15%的水平。

我們的試驗證明，在生產(chǎn)工藝下游的擴增環(huán)節(jié)，經(jīng)微泡激活的細(xì)胞可保持活性,并且擴增效果優(yōu)于傳統(tǒng)磁珠技術(shù)分選獲取的T細(xì)胞的擴增效果。與現(xiàn)有手工技術(shù)相比，我們自主研發(fā)的模塊式自動化技術(shù)每個工藝環(huán)節(jié)預(yù)計至少分別提升效率10-20%。

現(xiàn)階段我們的實驗數(shù)據(jù)基本都來自健康供體細(xì)胞，預(yù)計不久的將來我們就能取得真實患者提供的細(xì)胞，從而獲得最新的比較數(shù)據(jù)。提取患者大量細(xì)胞進行新技術(shù)測試的確頗具挑戰(zhàn)。這些重度患者最需要的是將活細(xì)胞盡多用于CAR-T治療，而非研究。然而，我們正在與凍存了“過量”患者細(xì)胞的機構(gòu)合作，這些機構(gòu)會不定期地因患者在細(xì)胞進行處理前不幸地去世，或因患者提供了超過所需的數(shù)量，而留下過剩的細(xì)胞。鑒于這些細(xì)胞來自重癥患者且已凍存，接下來的幾個月內(nèi)我們能夠用這些最真實的細(xì)胞對我們的技術(shù)進行測試，希望所獲數(shù)據(jù)與健康捐贈者細(xì)胞試驗數(shù)據(jù)一致。

Q：這個設(shè)備平臺是否具有可擴展性？是否需要大量定制？

Coelho先生：CAR-TXpress™平臺設(shè)備可擴展，無需大量定制。事實上，我們設(shè)計的每個模塊（X-LAB™, X-WASH™ 或 X-BACS™），都只需要對其控制模塊進行編程。例如，如果需要純化MNC，僅需將控制模塊的程序根據(jù)原材料（即白細(xì)胞或外周血）稍作修改。一旦控制模塊進行了編程，CAR-TXPress™系統(tǒng)將持續(xù)重復(fù)這個程序。

為進行擴展測試，我們在當(dāng)?shù)匾粋€GMP細(xì)胞處理實驗室做了一組對比試驗。將外周血分成兩份等量樣本，其中一份樣本交由熟練技術(shù)員采用Ficoll法及磁珠法來分離并激活T細(xì)胞；將另一份樣本交由熟練技術(shù)員使用X-LAB™和X-BACS™技術(shù)進行T細(xì)胞分離與激活，兩組技術(shù)員同時開始操作。結(jié)果，第一組技術(shù)員用Ficoll法剛完成MNC純化，采用CAR-TXpress™系統(tǒng)的技術(shù)員已經(jīng)完成MNC純化、分選，并已激活CD3+細(xì)胞。

我們特地將CAR-TXpress™設(shè)計為模塊化系統(tǒng)，因為模塊化系統(tǒng)本身可以為企業(yè)有效控制成本，而非“瑞士軍刀”集成設(shè)備那般造價昂貴。采用模塊化平臺，便于自主設(shè)計高效工藝流程。

此外，MNC純化、分選和激活環(huán)節(jié)如果能夠顯著減少T淋巴細(xì)胞的損耗，完成轉(zhuǎn)導(dǎo)后則可對已修飾T細(xì)胞進行簡單沖洗，將之輸注患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)擴增。如果這種方法得到臨床驗證，則可大幅縮短從T細(xì)胞收集到臨床注射CAR-T細(xì)胞的時長。

Q：CAR-TXpress™系統(tǒng)不用Ficoll法或磁珠法分離和分選細(xì)胞，那么它的基本原理是怎樣的呢？

Coelho先生：Ficoll密度梯度分離法常用于從外周血或白細(xì)胞中分離純化MNC，且已沿用40余年，采用手工操作，耗時長且效率低。所有實驗技術(shù)員都用過這種方法。相信貴刊的很多讀者也都意識到這種方法的種種缺陷。對于需要CAR-T治療的患者而言，目標(biāo)MNC在生產(chǎn)工藝的第一環(huán)節(jié)就損耗了30%至60%，其中約50%為T淋巴細(xì)胞，這些損失無法挽回，也不應(yīng)讓急需CAR-T細(xì)胞治療的患者承擔(dān)。

磁珠法用于分離MNC中的T淋巴細(xì)胞，已沿用約25年，確實很有價值。然而，使用此方法規(guī)模化生產(chǎn)細(xì)胞以大面積供應(yīng)患者群體時，其表現(xiàn)出來的低產(chǎn)能、低細(xì)胞回收率及低純度會帶來許多挑戰(zhàn)。此外，正如前面所說的，用于激活的一些磁珠產(chǎn)品本身就存在問題（磁珠的量通常比激活細(xì)胞的數(shù)量還要多），以至于FDA要求臨床醫(yī)生在細(xì)胞清洗前后對磁珠數(shù)量進行計數(shù)。

相反，我們設(shè)計的脂質(zhì)殼微泡在細(xì)胞分選激活后便被釋放出來。轉(zhuǎn)導(dǎo)擴增后，殘余物質(zhì)經(jīng)洗滌自動去除。

Q：能否請您描述BACS的工作原理，告訴我們它與其他細(xì)胞分離法有何不同之處？

Coelho先生：我們的浮力激活技術(shù)（BACS）利用脂質(zhì)外殼、鏈酶親和素包裹氣泡，氣泡直徑2-3微米，與生物素化抗體結(jié)合來選擇、激活、或同時選擇激活靶細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞。

美國FDA非常了解微泡，并且批準(zhǔn)在診斷造影技術(shù)中使用微泡。微泡可從任何部位直接輸入至患者血管，分散到全身，采用恰當(dāng)?shù)某曅盘柲苁刮⑴菰隗w內(nèi)爆破，從而傳播信號，呈現(xiàn)出附近組織的影像，使臨床診斷醫(yī)生可以無創(chuàng)地“觀察”該組織。

常規(guī)細(xì)胞分選技術(shù)利用涂有抗體的磁珠來附著表面帶有抗原的靶細(xì)胞，然后通過磁場環(huán)境來捕獲靶細(xì)胞。采用該技術(shù)，無論是靶細(xì)胞還是非靶細(xì)胞都向下流經(jīng)具有磁場的狹窄通道。未附著磁珠的非靶細(xì)胞通過該通道時進入特定容器被清除。然而，靶細(xì)胞與非靶細(xì)胞的細(xì)胞混合物也會被磁場通道吸附，這也是該方法的局限性。因為捕獲的細(xì)胞群中存在著非靶細(xì)胞，從而降低了終產(chǎn)物中的靶細(xì)胞純度，且需要在轉(zhuǎn)導(dǎo)和T細(xì)胞擴增前增設(shè)工藝環(huán)節(jié)去除污染的單核細(xì)胞。

相反，CAR-TXpress™技術(shù)使用微泡/抗體復(fù)合物與靶細(xì)胞結(jié)合，改變了整體密度，離心分離時，非靶細(xì)胞下沉，靶細(xì)胞輕輕上浮，往非靶細(xì)胞相反的方向聚集（圖1）。

圖1：X-BACS™的工作原理

此外，我們的設(shè)備進行自動化處理所采用的特殊圓柱器皿帶有錐形處理倉（見圖1）。離心過程中，附著微泡的靶細(xì)胞緩緩上升至血漿上表層，T細(xì)胞回收率大于85%，單核細(xì)胞的去除率高于99%。

這非常重要，因為初步處理環(huán)節(jié)留下的T細(xì)胞無需再用昂貴耗時的工藝進行擴增。如果需要激活T細(xì)胞，可將CD3+和CD28+抗體同時與微泡結(jié)合（圖2），這也是X-BACS™技術(shù)的另一個重要特性。

圖2

我們認(rèn)為，較傳統(tǒng)磁珠技術(shù)而言，X-BACS™細(xì)胞分選與激活技術(shù)具有顯著優(yōu)勢。原因之一是脂質(zhì)殼微泡幾個小時內(nèi)會完全釋放，無需在操作前后進行微泡計數(shù)。

我們認(rèn)為CAR-TXpress™是一項突破性技術(shù)，具有簡化生產(chǎn)工藝流程的潛力，我們期待與合作伙伴共同推進這一技術(shù)。

Q：如果治療公司將BACS技術(shù)納入其生產(chǎn)工藝流程，是否會存在監(jiān)管障礙？

Coelho先生：每個國家都存在待解決的監(jiān)管問題，但并非無法克服，最好的辦法是建立一個主文件（Master File）。例如，熱動力醫(yī)療持續(xù)更新有關(guān)X-LAB™、X-WASH™和X-BACS™系統(tǒng)的主文件，涵蓋了MNC純化、靶細(xì)胞分選與激活。這個主文件包含了FDA需要的所有相關(guān)信息，作為研究人員在臨床試驗新藥申請（IND）中應(yīng)用這些系統(tǒng)的參考依據(jù)。X-BACS™試劑盒也載入主文件，存入與抗體、緩沖液和微泡相關(guān)的所有信息。

這些主文件也提供細(xì)胞制品中X-BACS™試劑殘留物的信息。微泡由親和性材料制成，這些材料在后續(xù)的處理過程中（轉(zhuǎn)導(dǎo)、洗滌、擴增、多次洗滌）會不斷減少。預(yù)計研究人員可在2019年初獲取這些主文件。

Q：很多人認(rèn)為材料供應(yīng)商單一導(dǎo)致風(fēng)險較高，您認(rèn)為生產(chǎn)商應(yīng)該采取哪些措施降低這些風(fēng)險？

Coelho先生：首先需要明白，我們的產(chǎn)品可作為現(xiàn)有細(xì)胞處理環(huán)節(jié)的補充，對潛在客戶來說這無疑是件好事情。

況且，熱動力醫(yī)療擁有30多年臨床細(xì)胞處理設(shè)備開發(fā)經(jīng)驗，所生產(chǎn)設(shè)備可重復(fù)使用數(shù)千次。因此，對于這些設(shè)備的需求，無需有采購數(shù)量的負(fù)擔(dān)。

更重要的是，與我們的電動設(shè)備配套使用的一次性處理套件和一次性試劑盒都能確保正常供應(yīng)，因為我們正與大牌供應(yīng)商簽署長期供貨協(xié)議。該供應(yīng)商信譽卓著，會按我們的要求生產(chǎn)處理套件和試劑盒，并且制定了災(zāi)難和風(fēng)險緩解方案。